Scholar Hub/Chủ đề/#real time rt pcr/
Real-time RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) là một phương pháp phân tích gene và xác định mức độ biểu hiện gen hiện tại trong một mẫu. Nó...
Real-time RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) là một phương pháp phân tích gene và xác định mức độ biểu hiện gen hiện tại trong một mẫu. Nó kết hợp hai kỹ thuật khác nhau - RT (đảo ngược chuyển) và PCR (Phản ứng chuỗi Polymerase) để phục vụ cho mục đích phân tích và đo lường mức độ biểu hiện gen một cách cụ thể.
Trong quá trình Real-time RT-PCR, RNA môi trường được chuyển thành DNA sử dụng enzyme reverse transcriptase. Sau đó, DNA này được nhân bản hàng triệu lần bằng PCR sử dụng primer đặcif để tạo ra số lượng lớn các đoạn cDNA. Quá trình PCR được theo dõi trực tiếp trong thời gian thực từng vòng, và kết quả đo lường được hiển thị ngay sau mỗi vòng PCR.
Real-time RT-PCR cung cấp thông tin về mức độ biểu hiện gen hiện tại trong một mẫu và cung cấp sự đo lường chuẩn xác và nhạy cảm. Phương pháp này được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu di truyền, y học, và sinh học phân tử để xác định mức độ biểu hiện gen trong các mẫu nghiên cứu.
Real-time RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) là một phương pháp phân tích gen dựa trên sự kết hợp giữa reverse transcription (RT) và polymerase chain reaction (PCR). Phương pháp này được sử dụng để phân tích và đo lường mức độ biểu hiện gen một cách định lượng và cung cấp thông tin về số lượng gen hiện tại trong một mẫu xác định.
Quá trình Real-time RT-PCR bao gồm các bước sau:
1. Chuẩn bị mẫu: RNA được trích xuất từ mẫu mô hoặc tế bào. RNA này chứa thông tin di truyền từ gen mục tiêu cần phân tích.
2. Reverse transcription (RT): RNA môi trường được chuyển đổi thành cDNA (Complementary DNA) bằng cách sử dụng enzyme reverse transcriptase. Các nucleotide có thể được sử dụng để đánh dấu cDNA để thuận tiện cho việc thu thập dữ liệu.
3. PCR amplification: Sự nhân đôi cDNA được thực hiện bằng cách sử dụng enzyme polymerase và các primer (một cặp primer ngược và tiến) nhằm nhân bản đoạn gen mục tiêu. Vòng lặp này sẽ làm tăng lượng gen mục tiêu tạo ra.
4. Detection: Trong quá trình PCR, một fluorochrome đặc biệt (như SYBR Green hoặc TaqMan probe) được sử dụng để theo dõi sự gia tăng lượng gen theo thời gian. Mỗi lần quá trình PCR hoàn tất, hàm lượng fluorochrome được đo lường và xác định sự tăng trưởng gen.
5. Analysis: Sử dụng các phần mềm phân tích đặc biệt, kết quả dữ liệu thu được từ quá trình PCR được phân tích và biểu đồ hoá. Mức độ biểu hiện gen trong mẫu được xác định dựa trên tham số như quãng thời gian tăng trưởng (Ct), tương ứng với số vòng PCR cần thiết để đạt được ngưỡng nhất định của gen mục tiêu.
Real-time RT-PCR cho phép người ta giám sát và đo lường mức độ biểu hiện gen một cách chính xác và nhạy cảm. Nó được sử dụng trong nhiều lĩnh vực như nghiên cứu di truyền, sinh học phân tử, y học dự đoán và xác định chẩn đoán.
Phát hiện coronavirus mới 2019 (2019-nCoV) bằng kỹ thuật RT-PCR thời gian thực Eurosurveillance - Tập 25 Số 3 - 2020
Bối cảnh
Trong bối cảnh dịch bùng phát liên tục của coronavirus mới xuất hiện gần đây (2019-nCoV), các phòng thí nghiệm y tế công cộng đang gặp phải thách thức do chưa có được các mẫu virus cách ly, trong khi ngày càng có nhiều bằng chứng cho thấy dịch bệnh lan rộng hơn so với dự đoán ban đầu và sự lây lan quốc tế qua khách du lịch đang xảy ra.
Mục tiêu
Chúng tôi đặt mục tiêu phát triển và triển khai một phương pháp chẩn đoán mạnh mẽ để sử dụng trong môi trường phòng thí nghiệm y tế công cộng mà không cần có sẵn mẫu virus thực tế.
Phương pháp
Chúng tôi trình bày một quy trình chẩn đoán được xác thực cho 2019-nCoV, với thiết kế dựa trên quan hệ gen gần gũi của 2019-nCoV với coronavirus SARS, tận dụng công nghệ axit nucleic tổng hợp.
Kết quả
Quy trình này phát hiện chính xác 2019-nCoV và phân biệt 2019-nCoV với SARS-CoV. Thông qua sự phối hợp giữa các phòng thí nghiệm học thuật và công lập, chúng tôi đã xác nhận tính độc quyền của kết quả thử nghiệm dựa trên 297 mẫu lâm sàng gốc có chứa đầy đủ phổ virus đường hô hấp ở người. Vật liệu kiểm soát được cung cấp thông qua European Virus Archive – Global (EVAg), một dự án cơ sở hạ tầng của Liên minh Châu Âu.
Kết luận
Nghiên cứu hiện tại chứng minh năng lực phản ứng mạnh mẽ đạt được thông qua sự phối hợp giữa các phòng thí nghiệm học thuật và công lập trong các mạng lưới nghiên cứu quốc gia và châu Âu.
#2019-nCoV #chẩn đoán #RT-PCR #y tế công cộng #lây lan quốc tế #phối hợp phòng thí nghiệm #phương pháp mạnh mẽ #kiểm soát dịch bệnh #công nghệ axit nucleic tổng hợp
Định lượng mRNA bằng phương pháp PCR Ngược Dòng Thời gian Thực: xu hướng và vấn đề Journal of Molecular Endocrinology - Tập 29 Số 1 - Trang 23-39 - 2002
Phương pháp PCR Ngược Dòng Thời gian Thực dựa trên huỳnh quang (RT-PCR) được sử dụng rộng rãi để định lượng mức mRNA ở trạng thái ổn định và là một công cụ quan trọng cho nghiên cứu cơ bản, y học phân tử và công nghệ sinh học. Các thử nghiệm dễ tiến hành, có khả năng xử lý khối lượng lớn, và có thể kết hợp độ nhạy cao với độ đặc hiệu đáng tin cậy. Công nghệ này đang tiến hóa nhanh chóng với sự xuất hiện của các enzym, hóa chất và thiết bị mới. Tuy nhiên, mặc dù RT-PCR thời gian thực đã giải quyết nhiều khó khăn vốn có trong RT-PCR thông thường, nó đã trở nên ngày càng rõ ràng rằng nó tạo ra những vấn đề mới cần giải quyết cấp thiết. Do đó, bên cạnh việc cung cấp bức tranh tổng thể về công nghệ RT-PCR thời gian thực, bài đánh giá này còn có mục tiêu bổ sung: sẽ mô tả và thảo luận cụ thể một số vấn đề liên quan đến việc giải thích các kết quả có tính chất số học và dễ dàng phân tích thống kê, nhưng độ chính xác của chúng bị ảnh hưởng đáng kể bởi sự biến đổi của hóa chất và người điều hành.
#PCR ngược dòng thời gian thực #định lượng mRNA #huỳnh quang #nghiêm ngặt #thống kê #y học phân tử #công nghệ sinh học #biến đổi hóa chất #xu hướng #vấn đề
Validation of reference genes for quantitative expression analysis by real-time RT-PCR in Saccharomyces cerevisiae Springer Science and Business Media LLC - Tập 10 Số 1 - 2009
Abstract
Background
Real-time RT-PCR is the recommended method for quantitative gene expression analysis. A compulsory step is the selection of good reference genes for normalization. A few genes often referred to as HouseKeeping Genes (HSK), such as ACT1, RDN18 or PDA1 are among the most commonly used, as their expression is assumed to remain unchanged over a wide range of conditions. Since this assumption is very unlikely, a geometric averaging of multiple, carefully selected internal control genes is now strongly recommended for normalization to avoid this problem of expression variation of single reference genes. The aim of this work was to search for a set of reference genes for reliable gene expression analysis in Saccharomyces cerevisiae.
Results
From public microarray datasets, we selected potential reference genes whose expression remained apparently invariable during long-term growth on glucose. Using the algorithm geNorm, ALG9, TAF10, TFC1 and UBC6 turned out to be genes whose expression remained stable, independent of the growth conditions and the strain backgrounds tested in this study. We then showed that the geometric averaging of any subset of three genes among the six most stable genes resulted in very similar normalized data, which contrasted with inconsistent results among various biological samples when the normalization was performed with ACT1. Normalization with multiple selected genes was therefore applied to transcriptional analysis of genes involved in glycogen metabolism. We determined an induction ratio of 100-fold for GPH1 and 20-fold for GSY2 between the exponential phase and the diauxic shift on glucose. There was no induction of these two genes at this transition phase on galactose, although in both cases, the kinetics of glycogen accumulation was similar. In contrast, SGA1 expression was independent of the carbon source and increased by 3-fold in stationary phase.
Conclusion
In this work, we provided a set of genes that are suitable reference genes for quantitative gene expression analysis by real-time RT-PCR in yeast biological samples covering a large panel of physiological states. In contrast, we invalidated and discourage the use of ACT1 as well as other commonly used reference genes (PDA1, TDH3, RDN18, etc) as internal controls for quantitative gene expression analysis in yeast.
Real‐time reverse transcriptase–polymerase chain reaction (RT–PCR) for measurement of cytokine and growth factor mRNA expression with fluorogenic probes or SYBR Green I Immunology and Cell Biology - Tập 79 Số 3 - Trang 213-221 - 2001
Real‐time quantitative reverse transcriptase–polymerase chain reaction (RT–PCR) is the method of choice for rapid and reproducible measurements of cytokine or growth factor expression in small samples. Fluorescence detection methods for monitoring real‐time PCR include fluorogenic probes labelled with reporter and quencher dyes, such as Taqman probes or Molecular Beacons and the dsDNA‐binding dye SYBR Green I. Fluorogenic (Taqman) probes for a range of human and rat cytokines and growth factors were tested for sensitivity and compared with an assay for SYBR Green I quantification using real‐time fluorescence monitoring (PE Applied Biosystems Model 7700 sequence detector). SYBR Green I detection involved analysis of the melting temperature of the PCR product and measurement of fluorescence at the optimum temperature. Fluorogenic probes provided sensitive and reproducible detection of targets that ranged from low (<10 copies/reaction) to high (>107 copies/ reaction) expression. SYBR Green I gave reproducible quantification when the target gene was expressed at moderate to high levels (≥1000 copies/reaction), but did not give consistently reproducible quantification when the target gene was expressed at low levels. Although optimization of melting temperature improved the specificity of SYBR Green I detection, in our hands it did not equal the reproducible sensitivity and specificity of fluorogenic probes. The latter method is the first choice for measurement of low‐level gene expression, although SYBR Green I is a simple and reproducible means to quantify genes that are expressed at moderate to high levels.
